RISORSE NATURALI

Il nostro lavoro ha permesso di identificare, tramite un’attenta caratterizzazione chimica e biologica in-vitro ed in-silico, un potenziale nuovo estratto vegetale in grado di modulare i livelli di colesterolo, ottenuto dalla resina di Protium heptaphyllum. L’innovazione portata da questa scoperta ha caratteri sia di processo che di prodotto, dal momento che è stato sviluppato un metodo estrattivo mirato alle componenti bioattive del botanical e, contemporaneamente, sono state individuate in varie classi e molecole non ancora identificate e caratterizzate. L’estratto risultante si trova ora commercializzato come ingrediente per integratori alimentari con nome Hepamyr® [1].

L’ipercolesterolemia è una forma di iperlipemia caratterizzata da alti livelli di colesterolo LDL circolante nel flusso sanguino. Questa condizione è spesso responsabile di varie complicanze cardiovascolari tra cui ipertensione, malattie cerebrovascolari, arteriose periferiche e coronariche, trombosi venose ed embolie polmonari [2]. È stimato che l’aterosclerosi, alla base delle sopracitate condizioni, e causata principalmente da iperlipidemia, sia imputabile di circa metà delle morti nella società occidentale [3].

La gravità e la diffusione di questa condizione hanno condotto allo sviluppo di svariate terapie; ad oggi quella di maggiore successo prevede l’impiego di molecole bioattive appartenenti alla famiglia delle statine, note per la loro capacità di interagire in modo mirato con importanti enzimi coinvolti nel metabolismo del colesterolo. Le statine sono in grado di alterare l’attività enzimatica della 3-idrossi-3-metil-glutaril coenzima A reduttasi (HMGCR), enzima chiave della via biosintetica del colesterolo, che media la trasformazione del 3-idrossi-3-metil-glutaril coenzima-A (HMGCoA) a mevalonato: esse esercitano un’azione di tipo inibitorio che porta ad una diminuzione della sintesi di mevalonato e, conseguentemente, del precursore iniziale utile per la sintesi di colesterolo.

Tuttavia, l’effetto di abbassamento dei livelli di colesterolo sortito dalla somministrazione di farmaci a base di statine spesso non è sufficiente a ripristinare i livelli fisiologici e non è raro l’insorgere di alcuni effetti indesiderati come mialgie, affaticamento, aumento del livello glicemico e stati di sofferenza epatici [2], [4].

Le statine naturali

Le statine impiegate e regolamentate come farmaci sono prevalentemente di origine sintetica, ma a queste si affiancano una serie di molecole organiche dalla struttura chimica simile, prodotte in natura dall’azione di alcune specie di funghi, e pertanto sono considerate delle vere e proprie statine naturali. [5]

L’uso di statine naturali è la scelta principe di molti pazienti in condizioni di ipercolesterolemia di gravità intermedia, in quanto i prodotti naturali e fitoderivati in generale sono percepiti come meno pericolosi e privi di effetti collaterali [2].

ALBERTO ASTEGGIANO

Università di Torino | Italia

Biosfered S.r.l. | Italia

La fonte più utilizzata di statine naturali è quella del riso rosso fermentato, ricco di molecole bioattive denominate monacoline in grado di esercitare un’azione farmacologica simile; tra queste la più conosciuta ed efficace è la monacolina k.

Nonostante il riso rosso fermentato sia una fonte naturale di statine, il suo utilizzo non è privo di controindicazioni ed effetti indesiderati: il processo fermentativo attuato dal fungo Monascus purpureus, può portare alla formazione di citrinina, una micotossina nota per i suoi effetti teratogenici, citotossici, nefrotossici e carcinogenici, anche a dosaggi bassi, che richiede uno stretto monitoraggio nei prodotti destinati all’uso umano [2].

In virtù di queste considerazioni, l’obiettivo di sviluppare integratori alimentari utili a regolare il metabolismo del colesterolo, basati su nuove materie prime e dal carattere innovativo, si delinea come primario.

Protium heptaphyllum (Aubl.) Marchand (Famiglia delle Burseraceae) è un albero ad alto fusto tipico della regione amazzonica del Sudamerica; la sua peculiarità è quella di sviluppare sul tronco un abbondante essudato resinico largamente ed anticamente impiegato dalle popolazioni amazzoniche locali come rimedio naturale per malanni stagionali, emicranie, dolori ossei e muscolari. L’uso di questa resina si perde nel passato e trova documentazione nella storia della popolazione afrobrasiliana dei Quilombolas, abitanti della foresta amazzonica fuggiti dalla schiavitù nelle piantagioni brasiliane[6], [7]. In un paper recente ne è riportato l’uso tradizionale contro le forme di emicrania tramite inalazione dei fumi provenienti dalla sua combustione [7]. Oltre alle proprietà analgesiche, la resina è impiegata per lenire stati infiammatori e come espettorante [6]. Evidenze scientifiche moderne, oltre che confermare le proprietà per cui questo prodotto naturale è utilizzato sin da tempi antichi[8]–[11] , hanno dimostrato la capacità di questa resina di interagire con il metabolismo del colesterolo tramite la modulazione dei livelli di colesterolo totale circolante, delle lipoproteine a bassa (LDL) e bassissima densità (VLDL) e, contemporaneamente, favorendo la formazione di HDL, il complesso lipoproteico noto come “colesterolo buono”[12], [13].

L’analisi chimica è un elemento chiave per coordinare le prove di processo estrattivo e permettere di focalizzare l’estrazione del prodotto finale a determinate molecole bioattive di interesse: allo scopo sono stati impiegati degli approcci strumentali di chimica analitica basati sulla cromatografia interfacciata alla spettrometria di massa. Per ottenere una caratterizzazione il più completa possibile, più tecniche complementari sono state utilizzate in contemporanea: GC-FID-MS (gas cromatografia accoppiata a rivelatore di ionizzazione di fiamma e spettrometria di massa) per le piccole molecole volatili e le più grandi molecole di natura neutra e HPLC-HRMS (cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa ad alta risoluzione) per le molecole non volatili, altobollenti e facilmente ionizzabili. La caratterizzazione chimica nella resina ha permesso di individuare 29 diverse molecole in tre differenti frazioni della resina: la frazione volatile, composta principalmente da mono e sesqui-terpeni, la frazione tri-terpenica neutra, composta da tri-terpeni a 30 atomi di carbonio neutri e quella tri-terpenica acida, composta da tri-terpeni tetra e pentaciclici con funzione acida. Alla luce dei risultati biologici ottenuti in-vitro, la procedura di estrazione del prodotto è stata condotta allo scopo di arricchire e concentrare la frazione tri-terpenica acida. [14]

Analisi in-vitro delle potenzialità anti-ipercolesterolemiche dell’estratto

La valutazione delle potenziali proprietà biologiche dell’estratto è stata condotta con tecniche di biologia molecolare e biochimica, monitorando l’attività e l’espressione genica di enzimi correlati alla sintesi, trasporto e metabolismo del colesterolo.

Regolazione dei livelli di colesterolo endogeno

In una fase preliminare, è stata investigata la capacità delle molecole ottenute dalla resina di Protium heptaphyllum di modulare i livelli di colesterolo in epatociti: l’estratto è stato quindi testato su cellule epatiche di ceppo THLE-3 utilizzando come confronto la forma attiva della lovastatina (statina sintetica riconducibile alla monacolina k) a concentrazione comparabile con quella dei dosaggi tipici di riso rosso fermentato. I risultati di questo esperimento hanno mostrato un decremento significativo dei livelli di colesterolo endogeno, mettendo in evidenza risultati molto simili tra l’estratto e la lovastatina pura ad un tempo di trattamento di 12 ore: in particolare il dosaggio più alto (200 µg/mL) di estratto ha avuto risposte comparabili a quelli di 10 µg/mL di lovastatina pura.

Interazione estratto-HMGCR

La capacità dell’estratto di modulare i livelli di colesterolo ha sollevato l’interrogativo del meccanismo coinvolto, è stata quindi testata una possibile interazione con HMGCR, enzima target delle statine vegetali e di sintesi.

Il meccanismo d’azione è stato studiato confrontando l’azione dell’estratto con quella della lovastatina tramite due approcci: una simulazione di docking molecolare, ossia una strategia computerizzata in grado di prevedere l’affinità di interazione tra le varie molecole presenti nell’estratto con l’enzima, ed un saggio di inibizione enzimatica.

La simulazione in-silico è stata condotta sul sito di legame di HMGCR impiegato anche dalla lovastatina per sortire il suo effetto inibitorio; i composti dell’estratto interessati maggiormente a questa interazione sono quelli appartenenti alla classe dei tri-terpeni acidi che registrano interazioni significative con gli aminoacidi della tasca enzimatica di HMGCR, sottolineando una possibile inibizione di quest’ultimo. A conferma della scoperta di una parziale inibizione dell’estratto su HMGCR in-silico, il saggio biochimico ha mostrato un’inibizione dell’HMGCR con un’entità inferiore a quella esercitata dalla statina naturale. Questo risultato ha portato a supporre che l’attività modulatrice fosse un’attività di concerto in grado di coinvolgere sia l’HMGCR che ulteriori pathway biochimici.

I risultati di inibizione enzimatica hanno spinto ad approfondire lo studio dei meccanismi non collegati all’enzima HMGCR attraverso i quali l’estratto potesse esercitare la sua attività di modulazione del colesterolo. La strategia scelta è stata quella di misurare l’attività di trascrizione dei geni deputati alla sintesi, metabolismo ed uptake cellulare del colesterolo, tra cui HMGCR, LDL-R (importatore di membrana del colesterolo), IDOL e PCSK9 (sequestratori e ubiquitinatori di LDL-R), FXR (inibitore del metabolismo del colesterolo operato dal citocromo-p 7A1) e PPARα (enzima coinvolto nella regolazione del profilo lipidico). I risultati, riportati anche in figura (Figura 1), hanno suggerito un interessante meccanismo di regolazione in cui all’abbassamento dei livelli di trascritto di HMGCR e di FXR, che portano rispettivamente ad una diminuzione della sintesi del colesterolo ed un aumento del suo metabolismo verso la via degli acidi biliari, si affianca un abbassamento dell’espressione dei livelli di IDOL e PCSK9 responsabili dell’inibizione – tramite sequestro – del recettore che media l’uptake di colesterolo nella cellula (LDL-R). LDL-R, quindi, non essendo degradato all’interno della cellula, è libero di svolgere la sua funzione di uptake del colesterolo dal flusso sanguigno. L’espressione del trascritto codificante LDL-R è abbassata da crescenti concentrazioni di estratto, questo dato (sintesi di recettore diminuita) concorda con quelli di abbassamento del suo rateo di degradazione, infatti, una maggior concentrazione di recettore in membrana ne implica una minor produzione e, pertanto espressione.

Il quadro risultante, dati in vitro e risultati dell’indagine molecolare, suggerisce un’inibizione generalizzata dei maggiori attori cellulari coinvolti nei processi biosintetici e metabolici del colesterolo sia al livello dell’espressione genica che a livello di regolazione a valle della sintesi proteica. Si può riassumere l’effetto come non solo dipendente dalla inibizione di HMGCR, ma complesso e articolato, la cui via per la totale comprensione è ancora lunga e in fase di indagine dai gruppi di ricerca coinvolti nella sperimentazione in vitro. Le attuali conoscenze pongono i fondamenti per ulteriori studi, tra cui, il più importante, uno studio clinico pilota su pazienti affetti da disturbi metabolici legati al colesterolo realizzato in collaborazione con l’Università di Torino.